一、实践背景与选题缘起

本次实践依托2026年“小我融入大我，青春献给祖国”主题社会实践“智创未来”科创报国专业实践方向，紧扣高校师生科创赋能、科技成果落地服务中国式现代化的核心要求，立足临床医学专业优势与大同本土特色产业资源，聚焦药食同源草本创新应用，开展口腔护理科创研发实践，实现青年科创力量与地方产业、民生健康的深度融合。

从产业与地域背景来看，大同黄花是大同市标志性特色农业产业与经典药食同源食材，兼具极高的食用价值与药用功效。据权威资料记载，大同黄花富含卵磷脂、多种维生素、铁、钙等营养成分，性平入药，具备清热消肿、抑菌养护、舒缓修护等药理作用，天然温和、安全性高，无传统化工口腔护理产品的刺激性弊端，具备开发天然健康护理产品的优质天然原料基础，是极具科创挖掘价值的本土特色资源。

从民生健康市场背景来看，当下国民口腔健康需求持续升级，牙周炎、口腔菌群失衡、口腔异味、黏膜轻微炎症等日常口腔问题高发。随着全民健康意识提升，天然草本、温和抑菌、安全无害的功能性口腔护理产品成为市场刚需，天然药食同源口腔护理产品的研发与落地拥有广阔的市场前景与民生价值。

二、灵感来源

1. 文化灵感

大同黄花是大同市标志性地理标志农产品，作为塞北大地孕育出的道地药食同源物产，拥有数百年的种植历史，早已深深融入大同本地农耕文化与地域发展脉络。黄花不仅仅是当地农民增收致富的特色农作物，同时也是传统中医药体系中记载的药食两用食材，古籍典籍记述黄花性平、味甘，具备清热利湿、解毒消肿、舒缓疮疡肿痛的传统效用，内服可调养身体，外用可舒缓局部红肿炎症，为草本外用护理提供了传统理论根基。

立足于地域文化传承与产业升级双重角度，我们实践队萌生了本次项目的构思：将大同黄花这份本土文化物产，跳出单纯食用的传统定位，结合中医药传统外治思想，把黄花清热抗炎、舒缓修护的传统药性应用到口腔护理领域。一方面依托黄花打造带有大同边塞地域标签的康养文创类口腔产品，让地方物产赋能民生健康；另一方面将本土草本文化、中医药文化和旅居康养场景相互结合，让传统药食同源资源适配现代口腔养护需求，实现传统文化的现代化转化，这成为本项目重要的文化层面灵感。

2. 科学灵感

项目的科学灵感来源于对多篇草本漱口水、口腔护理方向学术文献的研读与对比分析。通过梳理现有研究发现，天然植物中的黄酮、多糖、多酚类活性物质，是口腔护理领域极具潜力的原料。其中黄酮类化合物是黄花菜核心功能性成分，具备抗氧化、抗炎、神经保护、改善睡眠、抗抑郁、护肝等多种生理活性，开发天然黄酮类功能物质在研究黄花药食同源口腔保护上具备良好研究前景。此外，黄花菜除黄酮之外还含有秋水仙碱等生物碱活性物质，秋水仙碱具备抑菌活性，可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，对pH、紫外照射稳定性较好。

而多篇文献证实，山苍子、金银花、佩兰等多种草本植物，均可开发无乙醇的温和漱口水，植物活性成分可以通过破坏致病菌细胞膜、抑制细菌增殖代谢实现抑菌效果，同时不会像化学消毒剂一样无差别杀灭口腔全部微生物，由此可推断以黄花为主要元素的基础上辅以其他草本植物开发药食同源口腔护理产品具有较高可行性。

《双花甘芍饮漱口水对中重度慢性牙周炎患者临床观察》等临床类文献让我们进一步得到启发，中药复方配伍模式，利用多味草本协同作用，能够有效降低牙周菌斑数量，下调龈沟液当中TNF‑α、hs‑CRP等炎症因子，实现辅助抗炎，其温和特性适合炎症期口腔黏膜，这为项目采用“大同黄花为君，金银花、甘草、淡竹叶为辅”的君臣佐使复方思路提供循证参考。同时部分针对放疗性口腔黏膜炎的相关研究证明，草本中的多糖组分拥有抗氧化功效，可以舒缓充血、受损黏膜，促进黏膜状态修复，这恰好匹配老年人群口腔黏膜萎缩、干燥脆弱、容易泛红受损的生理特点。

综合上述文献的成功经验、现有产品缺陷以及研究空白，确定以大同黄花作为核心原料，开发面向康养人群的复方草本漱口水，并且联动口腔门诊，构建产品加服务的完整模式，形成了本项目核心科学灵感。

三、理论设计

（一）产品定位与目标人群

产品定位：基于大同黄花药食同源特性的天然口腔黏膜护理产品。

目标人群：

复发性口腔溃疡患者；牙龈炎、牙周炎辅助护理人群；正畸患者（托槽摩擦导致口腔黏膜损伤）；追求天然成分的口腔护理消费者

（二）提取工艺路线（理论设计）

1. 黄花黄酮的提取与分离

样品预处理（大同鲜黄花 → 低温干燥（≤50℃，保留活性） → 粉碎过筛） → 脱脂除杂 → 超声辅助乙醇提取黄酮 → 酸水解 → 大孔树脂纯化（富集精制）→ 干燥制黄酮粉 （详见附件2 黄花提取物制备SOP）

2.黄花黄酮漱口水的配制

（1）基础配方（温和配方，无刺激、适配口腔）

去离子纯化水 1000 mL、黄花黄酮提取物（含槲皮素、木犀草素）200–300 mg、丙二醇（保湿助溶）20 g、甘油 10 g、吐温-80（助溶分散）0.5 g、薄荷醇 0.1 g、甜菊糖苷 0.05 g、尼泊金乙酯（食品级防腐剂）0.2 g，可按需添加少量柠檬酸钠调节口感与pH。

（2）标准化制备步骤

①基底配制：取纯化水，加入丙二醇、甘油，常温搅拌至完全溶解，作为漱口水基底溶液。

②黄酮溶解：将黄花黄酮提取物与少量乙醇、吐温-80预溶，充分分散无沉淀后，缓慢加入基底溶液中，低速搅拌15 min，保证黄酮均匀分散、无团聚析出。

③调味防腐：依次加入薄荷醇、甜菊糖苷、防腐剂，搅拌溶解均匀，全程温度≤40 ℃，避免黄酮高温降解。

④定容过滤：冷却至室温后，纯化水定容至1000 mL，采用0.22 μm水系滤膜过滤除菌，避光密封保存，制得黄花黄酮功能性漱口水。

（三）黄花黄酮漱口水质量检测SOP

1. 感官理化指标检测

①性状外观：目视观察，合格标准为澄清淡黄色液体、无浑浊、无沉淀、无分层、无异味。

②pH值检测：采用校准后精密pH计测定，室温检测，合格范围5.5–7.0，适配口腔酸碱环境，避免刺激黏膜。

③稳定性检测：常温避光放置15 d、4 ℃冷藏放置30 d，观察无变色、无析出、无浑浊为合格。

2. 黄酮成分定量检测（核心指标）

总黄酮含量：采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法，以芦丁为标准品，510 nm波长测定吸光度，绘制标准曲线，计算漱口水总黄酮质量浓度，确保活性成分达标。

3. 微生物检测

无菌检查：涂布平板培养法，检测漱口水菌落总数，符合口腔护理制剂卫生标准，无杂菌污染。

4. 功效验证理论模型

（1）纸片扩散法（抑菌圈测定）

制备0.5麦氏浓度（1×10⁸ CFU/mL）的口腔菌群悬液，均匀涂布于TSA培养基。将无菌滤纸充分浸润待检测黄花黄酮漱口水后平整贴于平板，同时设置阴性对照（生理盐水）和阳性对照（如庆大霉素），37℃培养24小时后，采用十字交叉法测量抑菌圈直径，设置三组平行重复，客观评价样品对口腔致病菌的体外抑菌活性。

（2）体外菌斑生物膜模型法（抗菌斑成熟验证）

以磨毛玻璃棒为生物膜附着载体，结合人混合唾液与TSB培养液，分别体外培养48 h、96 h，构建早期、成熟口腔菌斑生物膜模型。采用黄花黄酮漱口水进行梯度干预处理，空白组不做干预，通过检测菌斑生物膜干重、活菌数量、生物膜结构完整性，评价漱口水对口腔菌斑形成、增殖、成熟的抑制与清除效果。

（3）产酸抑制试验（防龋机制验证）

取体外培养成熟的菌斑模型，置于含胰蛋白胨、葡萄糖的标准化产酸培养液中恒温培养，持续动态监测培养体系pH值变化，记录各组菌群产酸速率及平衡pH值，对比空白组差异，验证黄花黄酮漱口水可有效抑制致龋菌代谢产酸、改善口腔酸性致病微环境，阻断龋齿发展进程。

（4）离体牙龋损模型法（牙体硬组织保护验证）

收集临床无龋、无缺损、无充填的健康人离体恒牙，消毒灭菌后接种变形链球菌，恒温密闭培养28 d，构建稳定离体龋齿损伤模型。将建模成功离体牙随机分组，分别给予黄花黄酮漱口水、空白溶剂、市售漱口水干预。采用Keyes评分法评估牙体龋损分级深度；通过光学显微镜、扫描电镜（SEM，×2000、×20000）观察牙体表面形貌，分析牙釉质脱矿、牙本质小管钙质流失及细菌侵入情况，量化评价样品防龋护齿效果。

（5）细胞抗氧化损伤模型验证（黏膜修护机制）

以人口腔黏膜上皮细胞为实验模型，采用H₂O₂构建细胞氧化应激损伤模型，模拟口腔溃疡、正畸黏膜摩擦损伤的氧化炎症微环境。设置空白对照组、模型组、不同浓度黄花黄酮漱口水干预组，通过检测细胞内ROS活性、SOD、GSH-Px抗氧化酶活力及MDA丙二醛含量，评价漱口水清除氧化自由基、提升细胞抗氧化能力、减轻黏膜氧化损伤、促进破损黏膜修复的作用机制。

（6）体外黏膜创伤愈合实验（创面修复验证）

采用口腔黏膜上皮细胞划痕愈合实验，体外模拟口腔黏膜破损、创面损伤状态。统一细胞铺板密度、划痕宽度，分组给予黄花黄酮漱口水梯度浓度干预，分别在24 h、48 h显微镜拍照记录划痕愈合面积，计算细胞迁移愈合率。对比空白组差异，直观验证漱口水对摩擦损伤、溃疡性口腔黏膜创面的加速修复、愈合促进效果，适配正畸黏膜损伤、复发性口腔溃疡的功效验证场景。

5. 安全性评估

（1）小鼠急性经口毒性试验

选取健康清洁级小鼠开展经口毒性实验，给予高剂量漱口水原液干预，连续观察7 d小鼠饮食、活动、精神状态、死亡情况，每日记录体重变化，实验结束后解剖观察心、肝、脾、肺、肾等脏器病理形态，判定样品急性毒性等级，验证误食、口腔残留接触安全性。

（2）金黄地鼠颊囊黏膜刺激试验

构建金黄地鼠颊囊口腔黏膜损伤模型，每日定时采用待测漱口水浸润刺激颊囊黏膜，持续干预14 d。每日观察黏膜有无充血、红肿、糜烂、破溃等不良反应，实验周期结束后取黏膜组织制作病理切片，镜下观察组织形态，评价产品对口腔黏膜的刺激性与生物耐受性。

（3） MTT细胞毒性试验（HGF人牙龈成纤维细胞）

体外培养人牙龈成纤维细胞（HGF），设置不同浓度、不同作用时间的漱口水干预组，通过MTT法检测细胞增殖活性与细胞存活率，分析样品对口腔正常细胞的生长影响，判定样品无细胞毒性，适配长期口腔黏膜接触使用。

（4）体外溶血试验（血液相容性验证）

采集新鲜抗凝兔血，制备稀释红细胞悬液，设置阴性对照（生理盐水）、阳性对照（蒸馏水）及不同浓度黄花黄酮漱口水实验组。恒温孵育后离心取上清，测定各组吸光度，计算溶血率。判定标准：样品溶血率＜5%即为无溶血风险，验证漱口水接触口腔黏膜微血管、微量血液时的生物安全性，规避口腔破损、创面使用风险。

6. 评价指标

结合体外实验、微观分子检测、宏观临床表征与主观疗效评价，建立多维度、可量化的完整评价指标体系，精准评定黄花黄酮漱口水的口腔护理与辅助治疗效果。

（1）临床牙周宏观指数

统一检测核心牙周临床指标：Silness-Löe菌斑指数（PLI）、牙龈指数（GI）、牙周探诊深度（PD）、出血指数（BOP/SBI）、简化口腔卫生指数（OHI-S）、牙周附着丧失（AL），通过干预前后组内、组间对比，直观评估牙龈红肿、出血、菌斑堆积、牙周损伤的改善情况。

（2）龈沟液炎性介质水平检测

采用无菌吸潮纸尖插入受试者龈沟静置1 min，采集龈沟液（GCF）样本，低温离心获取上清液。通过ELISA法、免疫比浊法检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、TGF-β、hs-CRP等核心炎性因子含量，从分子层面量化评价产品抗炎修护功效。

（3）口腔微生态多样性评价

采集受试者Ramfjord指数牙位龈上菌群样本，开展16S rRNA基因高通量测序。采用Ace指数、Chao指数评价口腔菌群丰度，Shannon指数、Simpson指数评价菌群均匀度，分析漱口水对口腔微生态失衡的调节作用，明确其改善口腔微环境的机制。

（4）口气挥发性硫化物（VSC）检测

受试者严格执行12 h禁食、禁刷牙、禁漱口预处理，晨起空腹采用Halimeter plus专业口气检测仪测定口腔挥发性硫化物（VSC）数值，对比干预前后VSC含量变化，客观量化产品抑制口臭、净化口腔气味的效果。

（5）口腔黏膜炎分级与临床疗效评价标准

采用国际RTOG黏膜损伤分级标准，评估复发性口腔溃疡、正畸摩擦性黏膜损伤的严重程度。统一临床疗效判定标准：显效（疼痛完全消除、黏膜红肿消退、溃疡创面缩小1/3以上、1周内基本愈合，满足3–4项）；有效（满足1–2项改善指标）；无效（症状、创面无明显改善甚至加重）。

四、博伦口腔线下调研过程

1. 调研准备

时间：2026年7月27日

地点：博伦口腔

调研人：刘雨佳

为保障大同黄花草本口腔抑菌漱口水研发的科学性、临床适配性与市场实用性，本次实践前期完成全方位、专业化调研筹备工作。首先，团队结合临床医学专业知识与项目研发需求，明确调研核心目标，聚焦临床口腔常见问题、现有漱口水应用痛点、不同人群口腔护理需求、草本抑菌产品临床适配性四大核心方向，确定调研核心内容与访谈提纲。其次，系统梳理大同黄花的药食同源功效、抑菌药理特性、天然修护优势等相关文献与官方资料，夯实产品研发的理论基础，确保调研与研发方向贴合草本药理特性。

此外，团队结合口腔临床诊疗场景，设计患者口腔护理需求调查问卷、临床医师访谈记录表，提前梳理现有市面口腔护理产品的优缺点，整理调研重难点，明确团队成员分工，分为访谈记录组、资料整理组、市场调研组、素材留存组，严格落实调研安全管理要求，制定线下调研安全预案，为实地调研的有序开展筑牢基础。

2. 调研过程记录

本次线下调研依托博伦口腔专业临床场景开展，全程遵循严谨、务实、专业的原则，分为临床观摩、医师深度访谈、患者需求调研、产品适配研讨四个阶段，全程留存影像资料、访谈记录与调研数据，确保调研真实有效、贴合临床实际。

第一阶段为临床场景观摩学习。团队成员进入博伦口腔诊疗区域，观摩日常口腔诊疗、牙周护理、术后口腔养护等实操流程，重点记录门诊高频接诊的口腔问题，包括口腔菌群紊乱、黏膜敏感、牙周轻微炎症、术后口腔护理不适等常见病症，了解不同年龄段、不同体质患者的口腔护理难点，掌握临床一线真实诊疗现状，为产品功能定位提供临床依据。

第二阶段为专业医师深度访谈。团队围绕草本口腔产品研发、现有漱口水临床应用弊端、天然抑菌成分适配性等核心问题，与博伦口腔资深执业医师开展一对一专项访谈。访谈过程中，团队详细记录医师关于口腔抑菌护理的专业建议，重点咨询天然草本成分在口腔护理中的安全性、有效性，以及针对敏感人群、术后养护人群的产品适配要求，同时请教临床中抑菌、舒缓、修护三位一体的口腔护理核心需求。

第三阶段为研发适配专题研讨。调研后期，团队与博伦口腔医师针对大同黄花漱口水研发方案开展专项研讨，结合黄花天然抑菌、清热修护、温和无刺激的特性，探讨产品配方优化、浓度适配、适用人群定位、临床试验方案设计等核心内容，初步确定产品研发的核心功能、适配场景与后续临床测试方向，完成本次线下调研全部流程。

3. 调研核心发现

通过本次博伦口腔全方位线下调研，结合临床诊疗现状、医师专业意见与用户真实反馈，团队梳理出四大核心调研成果，为产品研发优化提供关键支撑：

第一，现有市面口腔抑菌产品存在明显临床短板，适配性不足。调研发现，市面上主流抑菌漱口水多依赖化学抑菌成分与酒精添加剂，抑菌效果虽快，但刺激性较强，长期使用易破坏口腔正常微生态菌群，导致口腔黏膜干燥、刺痛、味觉短暂异常等问题。针对儿童、青少年、口腔黏膜敏感者、牙周术后养护人群，传统化学类漱口水适配度极低，临床亟需温和、安全、兼具抑菌与修护功效的天然口腔护理产品。

第二，大同黄花药食同源特性高度适配口腔临床护理需求。结合医师专业解读与黄花药理特性可知，大同黄花天然成分具备抑菌抗炎、清热消肿、舒缓黏膜、抗氧化修护的作用，药性温和、安全性高，无副作用，既可以有效抑制口腔有害菌群、改善口腔炎症与异味，又能修护轻微受损口腔黏膜、调节口腔微生态，完美契合日常口腔护理、术后温和养护、敏感肌口腔维稳的临床需求，具备极高的产品研发可行性与临床推广价值。

第三，大众对天然草本口腔科创产品接受度高，市场需求旺盛。本次患者抽样调研结果显示，超九成受访者表示对化学漱口水的刺激性存在使用顾虑，愿意尝试药食同源天然口腔护理产品，普遍期待兼具“安全抑菌、温和修护、日常养护”三重功效的刚需型口腔产品，尤其青睐依托本土特色食材研发的健康产品，为后续产品落地推广、市场化应用奠定了良好的群众基础。

第四，临床端明确产品核心研发优化方向。结合博伦口腔医师专业建议，团队明确产品研发核心定位：摒弃高刺激化学添加剂，以大同黄花天然萃取物为核心抑菌养护成分，主打“温和抑菌、黏膜修护、长效维稳”，适配全年龄段人群，重点覆盖口腔敏感群体、牙周术后护理人群、日常口腔养护人群；同时需优化萃取工艺，平衡抑菌效果与使用口感，保障产品安全性与实用性，为后续临床试验、产品迭代、成果落地提供了清晰的研发路径。

五、讨论与展望

1.创新点

首次将大同黄花引入口腔护理领域，拓展了黄花药食同源的应用边界

“文化—科学—临床”三维研发范式，为地方特色资源的产业化提供了方法论参考

2.挑战与对策

3.下一步计划

2026年9月：完成黄花提取物的工艺优化和成分分析

2026年10-11月：完成体外抑菌、抗炎、细胞迁移实验

2026年12月：完成含漱液小试配方，提交博伦口腔进行临床初评

2027年1月：启动专利申请（发明+外观）

六、总结

本次实践以“大同黄花”为起点，以“博伦口腔”为锚点，完成了从文化灵感挖掘、科学理论设计到临床需求验证的完整闭环。这不仅是一次产品研发的理论探索，更是一次“地方资源+临床需求”的产学研实践。黄花之“忘忧”，或许正可以在口腔护理中真正实现——让患者忘记口腔溃疡之忧，这正是我们研发的初心所在。

附件一：

博伦口腔实地调研文字记录

访谈时间：2026年7月27日

访谈地点：山西省晋中市平遥县博伦口腔品美门诊部

访谈人员：刘雨佳

访谈对象：博伦口腔资深执业医师

访谈形式：一对一线下专项访谈、研发方案研讨

访谈目的：了解市面漱口水临床应用弊端、草本抑菌成分适配性，明确大同黄花药食同源漱口水的研发方向、适用人群与临床优化要点

【访谈正文】

刘雨佳：医生您好，我们是临床医学专业社会实践团队，目前正在开展大同黄花药食同源口腔抑菌漱口水的研发实践。首先想请问您，在日常口腔临床诊疗中，患者最常出现的口腔护理问题主要有哪些？

口腔医师：从日常接诊情况来看，各类年龄段患者普遍存在口腔菌群紊乱、口腔黏膜敏感、轻微牙周炎症等问题。很多患者日常会自行使用市面漱口水护理，但不少人反馈使用后口腔干涩、刺痛，部分口腔黏膜脆弱、刚做完牙周基础治疗的患者，使用商品化漱口水后不适感会明显加重，整体适配性比较有限。

刘雨佳：那结合您的临床经验，目前市面上主流的抑菌漱口水，在临床应用中主要存在哪些短板和弊端？

口腔医师：现在大多数漱口水依靠酒精、人工合成抑菌剂来达到快速抑菌效果，优势是见效快，但缺点非常突出。第一，刺激性较强，容易损伤娇嫩的口腔黏膜，长期使用会破坏口腔正常菌群平衡，反而容易出现口腔干燥、味觉改变等问题；第二，受众局限性大，青少年、老年人、黏膜敏感人群以及牙周术后恢复期的患者，基本不建议频繁使用这类产品；第三，只注重抑菌，缺少黏膜舒缓、修护的作用，无法满足患者综合性的口腔护理需求。

刘雨佳：我们本次研发的产品以大同黄花天然草本成分为核心，依托药食同源特性做温和抑菌护理，想向您咨询，天然草本成分应用于口腔护理，在临床安全性和有效性上是否具备可行性？

口腔医师：大同黄花本身属于药食同源食材，药性温和，具备清热抗炎、舒缓修护、抑制有害菌群的作用，相比化学合成成分，最大的优势就是安全性高、刺激性极低，非常适配口腔长期养护的需求。从临床角度来说，天然草本成分既能辅助抑制口腔致病菌、缓解轻微牙周炎症和口腔异味，又不会破坏口腔正常微生态，对敏感人群、术后养护人群都十分友好，研发的可行性和临床价值都很高。

刘雨佳：结合临床诊疗需求，您认为一款优质的口腔护理漱口水，需要实现哪些核心功能？我们在产品研发中需要重点关注哪些适配要求？

口腔医师：临床最需要的是抑菌、舒缓、修护三位一体的综合护理效果。首先抑菌要有针对性，在清除有害菌的同时，保留口腔有益菌群；其次要兼顾黏膜舒缓修护，能够改善轻微炎症、缓解口腔干涩敏感问题；最后必须保证温和无刺激，适配全年龄段日常使用。你们在研发时，要重点把控草本萃取浓度，平衡抑菌效果和使用口感，避免浓度过高造成负担，同时规避各类化学添加剂，主打天然、安全、长效养护。

刘雨佳：非常感谢您的专业解答！最后想和您探讨一下，结合大同黄花的特性，我们这款漱口水在适用人群定位、临床试验开展、产品优化迭代上，您有什么专业建议？

口腔医师：建议你们将核心适用人群定位为青少年、老年人、口腔敏感人群以及牙周术后养护人群，这部分人群目前缺少适配的专属护理产品，市场和临床需求都很大。临床试验可以分阶段开展，先做小范围试用，记录不同人群的使用反馈，重点观察黏膜耐受度、抑菌效果、使用舒适度三项核心指标。后续可以根据临床数据优化配方比例，在保证功效的前提下提升使用体验，让产品真正贴合临床刚需、具备落地推广价值。

刘雨佳：好的，感谢您的悉心指导，我们将结合您的专业建议完善产品研发方案与后续试验计划。

【访谈结束】

访谈记录总结：本次一对一深度访谈，精准掌握了市面口腔护理产品的临床短板、天然草本口腔产品的应用优势，明确了大同黄花漱口水的研发核心、人群定位与临床试验优化方向，为项目后续配方优化、试验落地、成果转化提供了专业的临床支撑。

附件二：

黄花提取物制备SOP理论设计

1.目的

规范大同黄花（Hemerocallis citrina Baroni）水提物的实验室制备流程，确保每批提取物中黄酮含量≥2.0%、多糖含量≥1.0%，批间质量一致、操作可复现，为后续口腔护理产品研发提供稳定可靠的原料。

2.适用范围

适用阶段：实验室小试（50g~500g 原料/批）

适用对象：研发人员、质检人员

适用产品：以大同黄花为原料的水提物、醇沉多糖粗品、黄酮富集物

3. 原料、试剂与物料

3.1 原料要求

3.2试剂清单

3.3 耗材

4.仪器与设备

5.操作步骤

5.1 黄花原料预处理

5.1.1鲜黄花低温干燥

(1) 取新鲜大同黄花，摘除花梗、花托及杂质，仅保留花蕾及花瓣部分。

(2) 将花蕾均匀平铺于不锈钢托盘上，厚度不超过2cm，确保通风透气。

(3) 放入电热鼓风干燥箱中，设定温度45-50℃（不得超过50℃）。

(4) 干燥过程中每2-3小时翻动一次，保证受热均匀。

(5) 干燥至黄花变脆、一捏即碎，含水率≤10%（通常需12-24小时）。

(6) 取出后置于干燥器中冷却至室温。8.2.5 提取结束后，趁热用双层纱布粗滤，收集滤液于洁净的3000mL烧杯中。

5.1.2粉碎过筛

(1) 将干燥黄花剪成约1-2cm小段，投入高速粉碎机。

(2) 间歇式粉碎（每次20-30秒），避免长时间连续运转导致过热。

(3) 粉碎后的粉末过40目标准筛（粗粉）或60目标准筛（细粉）。

(4) 未过筛的粗颗粒重新粉碎，直至全部过筛。

(5) 收集粉末于密封袋中，标注名称、日期、目数，置于干燥器中保存备用。为“总水提物浓缩液”），用于黄酮总含量测定。

5.2脱脂除杂

(1) 准确称取黄花粉末100.0g（记录精确质量），用滤纸包好，置于索氏提取器提取筒中。

(2) 向圆底烧瓶中加入石油醚（沸程60-90℃）500mL（料液比约1:5 w/v）。

(3) 组装索氏提取器，连接冷凝管，打开冷却水。

(4) 水浴加热至60-70℃，使石油醚持续回流。

(5) 回流脱脂3-4小时，至提取筒中虹吸出的石油醚接近无色。

(6) 脱脂结束后，取出滤纸包，置于通风橱中摊开。

(7) 自然挥干至无石油醚气味（约2-4小时），残留溶剂要求≤50ppm。

(8) 脱脂后的粉末称重，计算脱脂率。

5.3提取黄酮

(1) 配制70%（v/v）乙醇提取液：量取无水乙醇700mL，加纯化水定容至1000mL，混匀。

(2) 将脱脂后的黄花粉末全部转移至1000mL烧杯或锥形瓶中。

(3) 加入70%乙醇1500mL（料液比约1:15 w/v）。粉末吸液后若不能完全浸没，补加溶剂至完全浸没。

(4) 用保鲜膜封口（防止超声过程中溶剂挥发及杂质落入），放入超声波清洗器中。

(5) 超声过程中每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，使粉末与溶剂充分接触。

(6) 超声结束后，趁热用布氏漏斗垫两层滤纸抽滤，收集滤液。

(7) 滤渣返回烧杯，再次加入70%乙醇1000mL（料液比1:10）。

(8) 重复超声提取一次（同条件，40分钟）。

(9) 抽滤，合并两次滤液，记录总体积。

(10) 将合并滤液转入旋转蒸发仪蒸发瓶（不超过瓶容积的2/3）。

(11) 旋转蒸发浓缩

(12) 浓缩至原体积的1/5~1/8（约300-500mL），呈深棕色浓稠液。

(13) 浓缩液转移至烧杯中，标注名称、体积，4℃冷藏备用。

5.4酸水解

(1) 将步骤三的浓缩液全部转移至500mL三颈烧瓶中。

(2) 加入等体积的2mol/L盐酸（即浓缩液：2mol/L HCl = 1:1，v/v），混匀。

(3) 2mol/L HCl配制：取浓盐酸（36%-38%，约12mol/L）167mL，加纯化水定容至1000mL。

(4) 三颈烧瓶装好冷凝管（回流），另一口塞好玻璃塞。

(5) 通入氮气（N₂）保护，流速约0.5L/min，赶尽瓶内空气后持续通入（防止苷元氧化）。

(6) 水浴加热至85-90℃，回流水解1.5小时。

(7) 水解过程中每隔30分钟取样一滴，TLC或HPLC监测水解进程（糖苷斑点消失，苷元斑点增强即为终点）。

(8) 水解结束后，冷却至室温。

(9) 用2mol/L NaOH溶液（80g NaOH溶于1000mL纯化水）逐滴中和至pH 6.5-7.0，用pH计监测。

(10) 中和后的溶液静置30分钟，若有沉淀析出则抽滤收集（沉淀为析出的黄酮苷元粗品）。

(11) 滤液（含中和产生的NaCl及其他水溶性杂质）保留，待上柱纯化冷阱温度≤-50℃，真空度≤10Pa，干燥时间24~48小时，至样品呈疏松粉末状。

5.5大孔树脂纯化

5.5.1大孔树脂预处理

(1) 称取AB-8大孔树脂200g（湿重），置于1000mL烧杯中。

(2) 加入95%乙醇500mL，浸泡24小时，充分溶胀。

(3) 用去离子水洗涤至无醇味（约洗5-8次，每次500mL）。

(4) 加入5% NaCl溶液500mL，浸泡4小时，去除残留单体和致孔剂。

(5) 去离子水洗至中性。

(6) 加入5% HCl溶液500mL，浸泡4小时，去除金属离子。

(7) 去离子水洗至中性。

(8) 加入5% NaOH溶液500mL，浸泡4小时，去除酸性杂质。

(9) 去离子水洗至中性（pH 7.0），备用。

(10) 预处理后的树脂悬浮于去离子水中，湿法装柱。

5.5.2 装柱

(1) 将层析柱（内径4cm，长50cm）垂直固定于铁架台上。

(2) 柱底垫一层脱脂棉或玻璃棉，防止树脂漏出。

(3) 先加入约1/3柱体积的去离子水。

(4) 将预处理好的树脂连水一起沿玻璃棒缓慢倒入柱中，避免产生气泡。

(5) 打开柱底阀门，让水缓慢流出，树脂自然沉降。

(6) 最终树脂床高度约20-25cm（柱床体积约250-315mL）。

(7) 树脂上方保留约2-3cm液面，防止干柱。

(8) 用2-3 BV（柱床体积）去离子水平衡，流速2 BV/h。

5.5.3 上样

(1) 将步骤四中和后的水解液（含黄酮苷元）用去离子水稀释至黄酮浓度约2-3 mg/mL。

(2) 上样前用0.45μm滤膜过滤，防止颗粒堵塞树脂。

(3) 以流速1.5 BV/h缓慢上样（约3.7-4.7 mL/min）。

(4) 收集流出液，待检测。

5.5.4 水洗除杂

(1) 上样结束后，用4-5 BV去离子水（约1000-1500mL）洗脱。

(2) 流速2 BV/h。

(3) 水洗目的：去除未吸附的盐类（NaCl）、残留糖类、蛋白等水溶性杂质。

(4) 收集水洗液，待检测。

5.5.5 乙醇洗脱

(1) 水洗结束后，用70%（v/v）乙醇进行洗脱。

(2) 洗脱体积：4-5 BV（约1000-1500mL）。

(3) 流速：2 BV/h。

(4) 用自动部分收集器分段收集，每管50-100mL。

(5) 每管取样检测黄酮含量（UV法，510nm显色，或直接测A₃₆₀吸光度）。

(6) 合并黄酮含量高的流份（吸光度≥0.3的管），即为纯化黄酮液。

5.5.6 树脂再生

(1) 洗脱结束后，用2-3 BV 95%乙醇洗脱残留强吸附物，流速2 BV/h。

(2) 用4-5 BV去离子水洗至无醇味。

(3) 用2-3 BV 5% HCl溶液洗脱，流速1 BV/h。

(4) 用4-5 BV去离子水洗至中性。

(5) 用2-3 BV 5% NaOH溶液洗脱，流速1 BV/h。

(6) 用去离子水洗至中性（pH 7.0）。

(7) 树脂短期保存（≤1周）：浸泡于去离子水中，4℃冷藏。

(8) 树脂长期保存（>1周）：浸泡于20%乙醇中，密封保存。

5.6干燥制黄酮粉

(1) 将步骤五收集的纯化黄酮液（70%乙醇溶液）转入旋转蒸发仪蒸发瓶。

(2) 旋转蒸发浓缩（条件同步骤三：45-50℃，-0.08~-0.09 MPa），浓缩至约原体积的1/5。

(3) 将浓缩液转移至培养皿或冻干盘中，液层厚度不超过1cm。

(4) 浓缩液先于-20℃预冻4小时以上至完全冻结。

(5) 转入冷冻干燥机，真空度≤10Pa，冷阱温度≤-50℃。

(6) 干燥24-48小时，至呈松散粉末状。

(7) 替代方案——真空干燥：

(8) 浓缩液置于真空干燥箱中，温度40-45℃，真空度-0.08~-0.09 MPa。

(9) 干燥至恒重（约12-24小时）。

(10) 干燥后的黄酮粉末用研钵轻轻研磨均匀。

(11) 称重，计算总收率。

附件三：

功效验证实验方案

1. 纸片扩散法

(1) 菌株：S. mutans / P. gingivalis / Lactobacillus

(2) 菌液：0.5 McFarland，涂布BHI平板

(3) 药敏纸片：滴加黄花黄酮 2, 5, 10 mg/mL

(4) 对照：阳性 0.2%氯己定 / 阴性 溶剂

(5) 培养：厌氧 37℃ 24-48h

(6) 测定：抑菌圈直径（mm）

(7) 判定：≥10mm 敏感 | 7-9mm 中度 | <7mm 不敏感

2. 体外菌斑生物膜模型法

┌─ 生物膜形成抑制 ─────────────────────┐

│ 96孔板唾液包被 → 加菌液+黄花黄酮     │

│ (0.5-5 mg/mL) → 厌氧37℃ 24h         │

│ → PBS洗 → 结晶紫染色 → OD₅₇₀         │

│ → 抑制率 = (OD对照-OD样)/OD对照×100% │

└──────────────────────────────────────┘

┌─ 成熟生物膜清除 ─────────────────────┐

│ 先形成24h生物膜 → 加黄花黄酮处理5min  │

│ → PBS洗 → 结晶紫染色 → OD₅₇₀         │

│ → 清除率 = (OD未处理-OD处理)/OD未处理  │

└─────────────────────────────────────

3.产酸抑制试验

S. mutans + 1%蔗糖BHI → 加黄花黄酮(1-5 mg/mL)

阳性对照：0.05% NaF

厌氧37℃ → 0h, 2h, 4h, 6h测pH

pH

7.0 ●────────●  阴性（快速下降）

6.0   ╲

5.5 - -╲- - - - - 釉质脱矿临界值

5.0     ╲──●  黄花黄酮（延迟下降）

└──┴──┴──┴──→ h

0   2  4  6

判定：黄花黄酮组pH降至5.5的时间显著延迟 → 抑制产酸有效

4. 离体牙龋损模型法

离体牙 → 环氧树脂包埋 → 暴露釉质窗(4×4mm)

↓

分组(n=6)：空白 | 龋损液 | 龋损液+黄酮(2,5 mg/mL) | NaF

↓

pH循环 ×14天（37℃）

┌─────────────────────────┐

│ 龋损液 pH4.5, 3h        │

│    ↓                    │

│ 人工唾液 pH7.0, 21h     │

│    ↓ 循环               │

└─────────────────────────┘

↓

检测指标：

├ 维氏显微硬度（硬度变化率%）

├ SEM釉质表面形貌

└ TMR脱矿深度(μm)

判定：硬度↓少 + 脱矿浅 + 表面孔隙少 → 有效

5.细胞抗氧化损伤模型

细胞：人口腔角质形成细胞(HOK)

↓

黄花黄酮安全浓度筛选（MTT, 0-200 μg/mL）

↓

分组：

空白 | H₂O₂(200μM) | 黄酮(10,25,50 μg/mL)+H₂O₂ | VC(50 μg/mL)

↓

黄花黄酮预处理24h → H₂O₂损伤2h

↓

┌────┼────┬────┐

▼        ▼        ▼        ▼

MTT         ROS       SOD       MDA

存活率       荧光      活性      含量

判定：vs H₂O₂组

存活率↑ + ROS↓ + SOD↑ + MDA↓ → 抗氧化保护有效

6.体外黏膜创伤愈合实验

HOK细胞 → 6孔板培养至融合90%

↓

200μL枪头划痕 → PBS洗 → 0h拍照

↓

加药：空白 | 黄酮(10,25,50 μg/mL) | EGF(10 ng/mL)

↓

37℃培养 → 12h, 24h, 48h拍照

↓

ImageJ测量划痕面积 → 愈合率(%)=(A₀-Aₜ)/A₀×100%

愈合率

100%│              ●EGF

│          ╱

80%│      ╱──● 黄酮

│  ╱──

60%│╱

│        ●空白

└──┴────┴────┴──→ h

0   12   24   48

判定：黄酮组愈合率显著>空白组 → 促进创面修复有效

组图：

指导教师：牛晓洁

团队名称：本草护齿实践队
团队介绍：团队由指导老师牛晓洁老师领衔，成员陈昱柠，刘雨佳、魏珺曦、王文静、谢事岑，皆为临床医学专业学生